Certal Residual DNA Detection Kits

Für den sensitiven sondenbasierten Nachweis von Rest-DNA aus CHO-Wirtszellen, einschließlich einer internen Kontrolle

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Certal CHO Detection Kit (100)

Cat. No. / ID:   211822

Für 100 × 25-µl-Reaktionen: 1,25 ml Certal Residual DNA PCR Master Mix, Certal Internal Control DNA und Assay, CHO DNA Positive Control und CHO-Assay, 100 µl Uracil-N-Glycosylase, 210 µl High-ROX Dye Solution, 210 µl ROX Dye Solution, Nucleic Acid Dilution Buffer, TE Buffer
Certal Residual DNA Detection Kits sind für molekularbiologische Anwendungen im Rahmen der Prüfung pharmazeutischer Produkte vorgesehen. Diese Produkte sind nicht zur Diagnose, Prävention oder Behandlung einer Erkrankung vorgesehen.Siehe Handelsmarken.

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Eigenschaften

  • Niedrige Bestimmungsgrenze mit hervorragender Reproduzierbarkeit
  • Großer linearer Bereich
  • Zuverlässige und präzise interne Kontrolle
  • Optimierte Protokolle für eine breite Palette von Real-time-Thermocyclern
  • Komplett-Kits, einschließlich interner Kontrolle und Positivkontrolle

Angaben zum Produkt

Bei der Arbeit mit Biopharmazeutika ist eine Prüfung des finalen therapeutischen Materials unerlässlich, um sicherzustellen, dass es frei von kontaminierenden Substanzen ist, z. B. von Rest-DNA der Wirtszelle. Certal Residual DNA Detection Kits wurden für die sensitive und schnelle Real-time-PCR-Quantifizierung von genomischer Rest-DNA aus der Wirtszelle mit doppelt markierten Hydrolyse-Sonden (auch als TaqMan® bezeichnet) entwickelt. Das Certal CHO Detection Kit enthält Reagenzien für den Nachweis von Rest-DNA aus CHO-Wirtszellen mittels Real-time-PCR im Duplex-Format sowie die Certal Internal Control. Darüber hinaus enthält das Kit die Certal Residual DNA Positive Control, die die Funktionsfähigkeit des PCR-Tests in Abwesenheit eines Signals der DNA der CHO-Wirtszelle verifiziert, sowie 2 Formate des passiven Referenzfarbstoffs ROX in verschiedenen Konzentrationen, die die Verwendung auf praktisch jedem Real-time-Gerät ermöglichen.

Leistung

Certal Residual DNA Detection Kits ermöglichen einen sensitiven und zuverlässigen Nachweis und eine Quantifizierung von genomischer Rest-DNA (gDNA), die für die Herstellung von sicheren und zuverlässigen Biopharmazeutika unerlässlich ist (siehe Abbildung „ Hoch sensitiver und zuverlässiger Nachweis“). Das Certal CHO Detection Kit ermöglicht den Nachweis von genomischer Rest-DNA aus Ovarienzellen des Chinesischen Zwerghamsters (CHO-Zellen) mit einer niedrigen Nachweisgrenze und über einen großen linearen Bereich. Dabei sind schon kleinste Mengen an genomischer Rest-DNA zuverlässig nachweisbar (siehe Abbildung „ Niedrige Nachweisgrenze“). Certal Residual DNA Detection Kits sind mit einer breiten Palette von Thermocyclern kompatibel und liefern sensitive und zuverlässige Daten (siehe Abbildungen „ Sensitiver und zuverlässiger Nachweis auf einer breiten Palette von Thermocyclern“ und „ Sensitiver und zuverlässiger Nachweis von genomischer CHO-DNA auf dem Rotor-Gene Q“).

Zur Gewährleistung einer hohen Prozesssicherheit enthalten Certal Residual DNA Detection Kits die QIAGEN Internal Control. Diese interne Kontrolle wurde speziell entwickelt, um die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse zu ermöglichen, ohne dabei den Zielassay zu stören. Die QIAGEN Internal Control wird bei Co-Amplifikation mit genomischer DNA zuverlässig nachgewiesen (siehe Abbildung „ Zuverlässiger Nachweis der QIAGEN Internal Control“).

Abbildungen ansehen

Prinzip

Um sicherzustellen, dass Verunreinigungen aus der Wirtszelllinie, die zur Herstellung von Biopharmazeutika verwendet wird, im endgültigen therapeutischen Material nicht mehr vorhanden sind, ermöglichen Certal Residual DNA Detection Kits als vorkonfigurierter Assay den spezifischen Nachweis von DNA aus CHO-Wirtszellen. Jeder Certal Residual DNA Assay besteht aus einem optimierten Primerpaar und einer FAM-markierten Hydrolyse-Sonde für den zuverlässigen Nachweis von genomischer CHO-Rest-DNA. Humane Hintergrund-DNA und Certal Internal Control DNA führen dabei nicht zu einer Störung des Certal Residual DNA Assays.

Der vorgemischte Certal Internal Control Assay enthält einen Forward- und einen Reverse-Primer sowie eine MAX-markierte Hydrolyse-Sonde für den Nachweis von Certal Internal Control DNA. Der Assay wurde speziell optimiert, um Störungen der Certal Residual DNA Assays zu vermeiden. Die Certal Residual DNA Positive Control ermöglicht die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse, indem sie die Funktionsfähigkeit der Amplifikationsreaktion selbst testet.

Der Certal ResDNA PCR Buffer wurde optimiert, um sensitive und zuverlässige quantitative Ergebnisse aus der Real-time-PCR im Duplex-Format zu liefern. Der Master-Mix enthält außerdem dUTP, was eine Vorbehandlung mit Uracil-N-Glycosylase (UNG) vor dem Start der PCR ermöglicht. Dadurch soll gewährleistet werden, dass etwaige kontaminierende PCR-Produkte die nachfolgenden PCR-Reaktionen nicht stören.

Komponenten des Certal Residual DNA Detection Kits
Komponente Eigenschaften Vorteile
Certal Residual DNA Assays und Control DNA
50x Certal Residual DNA Assay Vorkonfiguriertes, optimiertes und validiertes Primer-Sonden-Set (FAM-markiert) Zuverlässiger Nachweis von Rest-DNA aus CHO-Wirtszellen
Certal Residual DNA Positive Control Positivkontroll-DNA, die zur Amplifikation mit dem Certal Residual DNA Assay vorgesehen ist Überprüfung, ob der Certal Residual DNA Assay korrekt funktioniert, wenn in der Probe keine Rest-DNA der Wirtszellen nachgewiesen wird
50x Certal Internal Control Assay Vorkonfiguriertes, optimiertes und validiertes Primer-Sonden-Set (MAX-markiert) für den Nachweis von Certal Internal Control DNA Spezifischer Nachweis ausschließlich der Certal Internal Control DNA Optimiert, um Störungen der Certal Residual DNA Assays zu vermeiden
Certal Internal Control DNA Interne Kontroll-DNA, die zur Amplifikation mit dem Certal Internal Control Assay vorgesehen ist Ausschluss der Gegenwart von PCR-Inhibitoren oder zur Kontrolle der Aufreinigung und Amplifikation bei Zugabe während des Aufreinigungsschritts
Certal ResDNA PCR Master Mix
HotStarTaq DNA Polymerase   Aktivierung innerhalb von 15 Minuten bei 95 °C Ansatz der qPCR-Reaktionen bei Raumtemperatur
Certal ResDNA PCR Buffer Eine ausgewogene Kombination aus KCl- und (NH4)2SO4-Ionen Spezifische Primerhybridisierung für zuverlässige PCR-Ergebnisse
Synthetischer Faktor MP Zuverlässige Multiplex-Analyse von bis zu 4 Genen in einem Röhrchen
dNTP-Mix Enthält dUTP, das dTTP teilweise ersetzt und eine optionale UNG-Behandlung ermöglicht Effektive Beseitigung verschleppter PCR-Produkte bei Vorbehandlung der Reaktion mit Uracil-N-Glycosylase (UNG)
Zusätzliche Komponenten
50x ROX Dye Solution Separates Röhrchen mit passivem Referenzfarbstoff zur Normalisierung von Fluoreszenzsignalen auf Applied Biosystems 7500-Real-time-PCR-Systemen Optional: Kann auf Stratagene-Geräten von Agilent verwendet werden Präzise Quantifizierung auf Thermocyclern, die ROX-Farbstoff benötigen. Kann ohne Beeinträchtigung der PCR auf jedem beliebigen Real-time-Thermocycler verwendet werden
50x High-ROX Dye Solution Separates Röhrchen mit passivem Referenzfarbstoff zur Normalisierung von Fluoreszenzsignalen auf Applied Biosystems 7900- und StepOne-Real-time-PCR-Systemen
Uracil-N-Glycosylase (UNG) Separates Röhrchen mit reinem, nukleasefreiem rekombinantem Enzym Effektive Beseitigung verschleppter PCR-Produkte
QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer Proprietäre Pufferformulierung für die Verdünnung und Lagerung von Nukleinsäurestandards Stabilisiert RNA- und DNA-Standards während der Verdünnung und des Reaktionsansatzes und verhindert den Verlust von Nukleinsäuren durch Adsorption an Kunststoffoberflächen, wie z. B. Röhrchen oder Pipettenspitzen

Verfahren

Certal Residual DNA Detection Kits bieten ein einfaches Verfahren für den Nachweis von Wirtszell-DNA, Certal Internal Control und Certal Residual DNA Positive Control (siehe Abbildung  Verfahren des Certal Residual DNA Detection Kits). Mischen Sie einfach den mitgelieferten Master-Mix mit dem Certal Residual DNA Assay, dem Certal Internal Control Assay und der Certal Internal Control DNA und geben Sie dann Ihre Proben-DNA oder Certal Residual DNA Positive Control hinzu. Das Kit-Handbuch enthält optimierte Protokolle für die Verwendung auf einer Vielzahl unterschiedlicher Thermocycler. ROX wird in 2 Röhrchen mit unterschiedlichen Konzentrationen bereitgestellt, sodass es auf jedem Real-time-Gerät verwendet werden kann (siehe Tabelle „Auswahl der richtigen ROX-Konzentration“).

Auswahl der richtigen ROX-Konzentration
Gerät ROX Dye Solution
  Nicht erforderlich ROX Dye Solution High-ROX Dye Solution
Rotor-Gene Q X    
Rotor-Gene 6000 und Rotor-Gene 3000 X    
Applied Biosystems 7500, ABI ViiA7   X  
Applied Biosystems 7900HT, StepOne und StepOne Plus, ABI PRISM 7700, 7000 und 7300     X
Mx3000P, Mx3005P, Mx4000 X Optional  
iCycler iQ-System X    
LightCycler 480 X    
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Anwendungen

Certal Residual DNA Detection Kits ermöglichen eine sensitive Real-time-PCR mit sequenzspezifischen Sonden für den Nachweis von Wirtszell-DNA, einschließlich einer internen Kontrolle. Die Kits können auf einer breiten Palette unterschiedlicher Real-time-Thermocycler verwendet werden, darunter Thermocycler von QIAGEN, Applied Biosystems, Bio-Rad, Roche und Agilent.

Ergänzende Daten und Abbildungen

Ressourcen

Quick-Start Protocols (1)
Safety Data Sheets (1)
Kit Handbooks (1)
For sensitive real-time PCR detection of residual host cell DNA and an internal control using sequence-specific probes
Certificates of Analysis (1)

FAQ

Can the Certal CHO Positive Control DNA be used to create a qPCR standard for relative quantification?
For quantification, it is recommended that a gDNA standard from your production cell be prepared using, for example, the QIAamp DNA Mini Kit. The positive control provided with Certal Residual DNA Detection Kits is not suitable for use as a qPCR standard for relative quantification.
FAQ ID -2979
How many freeze-thaw cycles can the Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits tolerate?

The Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits can be freeze-thawed up to 6 times without a decrease in performance. However, great care should be taken to avoid inadvertently introducing RNases or DNases into the Internal Control template solutions. In general, in order to avoid repeated freeze-thaw cycles, we recommend preparing aliquots of the Internal Control template.

Note:  The Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits cannot be ordered separately

FAQ ID -2975
On which cyclers can Certal Residual Detection Kits be used?
Certal Residual Detection Kits can be used on virtually any real-time cycler. The master mix supplied with the Kits does not contain ROX. Instead, 2 different ROX concentrations are supplied in separate tubes. “High-ROX Dye Solution” is for use with all Applied Biosystems cyclers except the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems and the ViiA7 System, and “ROX Dye Solution” is for use with the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems, the ViiA7 System, and, optionally, instruments from Agilent. Recommendations are provided in the handbook (page 11).
FAQ ID -2973
What is the label of the probe that is used in the Internal Control Assay to detect the Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits?
The probe is labeled with the MAX-NHS ester (MAX) reporter dye, which has a spectrum equivalent to HEX, JOE, or VIC dyes. IowaBlack is used as the quencher dye. IowaBlack is a non-fluorescent quencher (dark quencher).
FAQ ID -2976
If a cycler from Applied Biosystems is used in combination with the Certal Residual DNA Detection Kit, should dye calibration for MAX be performed?

No, calibration is required if the instrument is already calibrated for VIC (which is normally the case). Simply create a new detector, for example, “MAX/IowaBlack”, and assign VIC as the reporter dye and “none” as the quencher (Table 3, page 17 of the Certal Residual DNA Detection Kit handbook describes the procedure in the footnote). 

MAX spectrum is nearly identical to VIC and the requirement for calibration has been thoroughly tested. There is no risk of crosstalk from the VIC channel to the FAM channel. However, crosstalk may occur from the FAM channel to the VIC channel if the pathogen target is present in very high copy numbers. Although this may slightly change the signal for the Internal Control, if a positive signal is detected in the FAM channel, then the Internal Control signal is no longer required.

FAQ ID -2977
On what cyclers have Certal Residual DNA Detection Kits been validated?
Certal Residual DNA Detection Kits have been validated on the Rotor-Gene Q and the Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time System.
FAQ ID -2978
Is there a risk of crosstalk from the FAM channel to the VIC channel if the residual DNA target is present in very high copy numbers?
Usually the amount of gDNA in process samples is low, for example, in the ng range or even lower. Therefore, no crosstalk is expected.
FAQ ID -2980
What is the nature and target of the Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits?

The Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits is a non-linearized plasmid (naked nucleic acid).

The Internal Control supplied with Certal Residual DNA Detection Kits has an artificial sequence that is not present in biological sample material.

FAQ ID -2974